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1938 年10月武汉会战后，中国的抗日战争开始进入相持阶段。依据蒋介石持久抗战的作战思想，国民党采取了以大西南为大本营，政府军一方面固守山区，伺机与敌举行会战或歼灭来犯日军，一方面在沦陷区以游击战消耗并牵制日本军力。日本则采取了切断中国对外交通，及轰炸大后方的战略，并采取“以华制华”，即扶植汪精卫在南京成立伪组织。在这一阶段，国民党仍然进行了顽强的抵抗，与日军进行了南昌会战，长沙会战等数个大型战役以及众多的战斗，取得了长沙大捷。
1941 年6月，德国突袭苏联。同年12月8日，日本偷袭珍珠港，美国对日宣战，太平洋战争爆发。这为中国抗日战争带来了新的契机，即融入世界反法西斯战争。蒋介石遂立即抓住他料之必至的历史机遇，于珍珠港事件发生当日，约见英、美、苏各国大使，宣布中国对轴心国宣战的决心。翌日七时，中华民国政府正式对日宣战（按：以往是应战），同时宣布对德、意两国立于战争地位。同日，蒋介石又主动致电罗斯福、邱吉尔、史达林，建议立即于反轴心国各国间组织某种联合军事会议。邱吉尔立即表示赞成，罗斯福主张迅速采取行动，史达林则藉口对德抗战而不愿意对日宣战。
1942年1月，在华盛顿发表了由美、中、英、苏三国领衔、有二十六国签署的“联合国共同宣言”，约定“加盟各国应各尽其兵力与资源打击共同的敌人，且不得与任何敌人军队单独媾和”。1942年1月3 日由罗斯福建议，蒋介石亦被正式推举为“中国战区”最高统帅，担负中、泰、越、缅北战区总指挥。诚如1941年12月23日蒋介石在重庆东亚联合军事会议上所指出的那样：“美、英、荷在太平洋上，早已成立共同作战计划，而始终不通知中国，是其视中国为无足轻重，徒利用我消耗日本实力……往者，美国限制日本，不许其南进北进，独不反对其西进。而今则日本全力侵华之危机，已不复存在矣！”。是故，“我国抗战，以后如能自强不息，则危险已过大半”。蒋介石的话，既指出了英、美、荷利用中国消耗日本力量的极端错误，又表示了蒋期望与世界大战“接轨”之持久战思想的正确无误。
10月初，蒋介石敦促美国率先自动放弃对华不平等条约；9日，美国与英国同时通知中华民国政府，愿与中国谈判缔结新的条约。蒋介石听说后，在日记中写道：“接获美、英自动放弃在我国治外法权重订新约之通告，此乃总理革命奋斗最大之目地，而今竟将由我手中达成，中心快慰，无以言喻。”蒋介石于次日国庆纪念大会中，向全体中国人宣布。11月，蒋夫人宋美玲应美国总统罗斯福夫妇之邀，前往美国访问。在访问期间，应邀至美国国会参众两院讲演，此后，又至纽约、波士顿、洛杉机、旧金山等地，又访问加拿大国会，均受邀发表演说。作为第一夫人的宋美玲的出访不仅为中国的外交开创了新的局面，而且为困境中的中国赢得了切实的援助。
1943年1月11日，中美、中英签订平等新约，危害中国百年的不平等条约，自此废除。不平等条约废除后，蒋介石先生发表《中国之命运》一书，勉励国人记取国耻教训，并鼓舞国人开拓国家光明的前途。
同年8月1日，国民政府主席林森逝世，中央推举蒋介石继任，蒋于10月10日就主席职。10月30日，中国与美、英、苏共同发表《四强宣言》，同负战后国际和平安全之责任。11月18日，蒋介石偕夫人启程前往埃及开罗，与美国罗斯福总统、英国邱吉尔首相，举行三国领袖会议。除关于军事与经济之各项协定外，并明确宣言：“所有日本窃夺之中国一切土地，如满洲、台湾、澎湖，均应由中华民国恢复之。”同时蒋介石提出的“日本之国体待战后由日本人民自行决定”，及 “扶助朝鲜与安南独立”之主张也为英美接受。
1944年处于颓势中的日军发动了“一号作战”，企图打通大陆交通线，即缅甸和中国的交通，情况一度危急。在民国政府的号召下，十万青年组成了远征军，进入印、缅解英军之围，并配合英军对日作战，并打通了中印公路，发动缅北反攻，取得了最终的胜利。日军企图占领印度的计划破产。
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